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今天给各位分享荧光定量pcr检测仪的知识，其中也会对荧光定量pcr仪有哪些品牌进行解释，假如能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！
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一、荧光定量PCR的操作步骤
荧光定量PCR实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
A260下读值为1表示40μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数× 40μg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260= 0.21
RNA浓度= 0.21×100×40μg/ml= 840μg/ml或 0.84μg/μl
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37%甲醛溶液(12.3 M)。
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中假如出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。①反应体系序号反应物剂量 1逆转录buffer 2μl 2上游引物 0.2μl 3下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5逆转录酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8总体积 10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
标准品反应体系序号反应物剂量 1 SYBR Green 1染料 10μl 2阳性模板上游引物F 0.5μl 3阳性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6阳性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8总体积 50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系：序号反应物剂量 1 SYBR Green 1染料 10μl 2内参照上游引物F 0.5μl 3内参照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6待测样品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8总体积 50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：序号反应物剂量 1 10×PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3上游引物F 0.5 ul 4下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8加水至总体积为 25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72℃延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下：序号反应物剂量 1 SYBR Green 1染料 10 ul 2上游引物 1ul 3下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6待测样品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8总体积 50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
二、实时荧光定量PCR仪有哪些种类,各有什么特点
1、目前市场上实时荧光定量PCR仪一般可分三类。
2、（1）金属板式实时定量PCR仪：可容纳的样本量大，无需特殊耗材，但温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。
3、（2）离心式实时定量PCR仪：能保障标准曲线和样品之间反应条件的一致性。但可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本。
4、（3）各孔独立控温的定量PCR仪：各孔独立控温，适合多指标快速检测。但是上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。
三、什么是实时荧光定量pcr仪
7900HT型荧光定量PCR仪的主要特点:
●高效平台-7900HT系统是为支持高通量而构建的，光学系统经优化以适用于384孔板荧光信号的激活和实时检测。
●结果可靠-7900HT系统采用了与7700、5700相同的定量原理，利用Ct值（Ct定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射的这一PCR循环）和起始拷贝数的对应关系，通过外标准曲线精确计算未知样品的起始拷贝数。
●高度重现性-7900HT系统的荧光检测发生在PCR对数期的起始，因此反应管中各组分没有任何限制反应因素，从而确保检测结果都是精确并能重复的。
●先进的荧光检测技术-RISM® 7900HT荧光定量PCR系统在不降低速度、分辨率的情况下有效提高了产率，这是基于先进的荧光检测技术：一束激光扫描并激活384个孔的每一个孔里的荧光染料，荧光信号通过光栅分光，经过分离的多色荧光同时到达CCD摄像机，实现多色荧光同时检测。
●自动进样装置-7900HT系统配备有自动化配件可取得最高效率。自动化装置可容纳84块384孔板，机械手臂可按一定顺序将待测样品板运送至主机内，配备的条形码阅读器（Bar code reader）可自动识别进入主机的样品板编号，使你在任何时间可以在样品行列中插入或替代样品板。
●多样的化学试剂-7900HT型荧光定量PCR仪上可使用的化学试剂包括TaqMan荧光探针法和SYBR Green荧光染料法。TaqMan探针法具有高度的灵敏度和特异性，适用于实时定量的多重反应或单核苷酸多态性分析（SNP）。SYBRGreen染料应用于目标鉴定（筛选测定）或者在只需用少数几个反应的测定中最为理想。
●有效防污染-7900HT系统在PCR全过程中使用专门设计的和始终密闭的样品管。在加入样品和试剂后这些管子便立即封闭并在扩增和检测过程中保持这种状态，这样就可以大大地减少污染的机会；此外，7900HT系统不存在PCR后处理，有效防止扩增产物对实验环境的污染而造成的假阳性。
●多种定量方法-ABIPRISM® 7900HT序列检测系统软件为基因表达提供一种定量化方法。绝对定量是从一个标准曲线上直接测定目标（基因）的量。相对定量方法是通过与标定样品相比较而计算未知样品的量，不需要标准曲线。
为了测定未知样品中的目标（基因）的数量，7900HT系统可用来测定样品的CT，然后用一条标准曲线来测定起始的拷贝数。在标准曲线的绘制中，7900HT系统软件首先用已知的起始拷贝数的几种稀释度计算它们的CT值。接着，软件使用测得的CT值对应于起始拷贝数的对数值作图。至少在五个数量级范围中两者呈线性关系。
对于基因表达研究来说，相对定量是理想的方法。这里不是应用标准曲线而是相对于标定样品计算表达水平。用一个内源对照来标定样品的量。这一方法与7900HT系统在一个多重反应中能同时对目标和内源对照进行定量测定的能力相结合，可实现高效、高通量的基因表达研究。
除实时定量测定以外，7900HT系统包括对于已知的单一核苷酸多态性（SNPS）作大规模筛选的软件。在一对等位基因系统中，用对应于两个等位基因的两个TaqMan探针在同一个试管中做多重PCR反应。反应终止时所产生的荧光用7900HT系统进行测定，实验结果通过分析软件迅速取得。
7900HT荧光定量PCR仪－384孔或96孔可更换式半导体控温PCR仪
仪器控制，数据采集及结果分析软件
Primer Express引物探针设计软件
实时定量检测－5000样品/天（标准模式），96样品/35分钟（快速模式）
终点SNP分析－30000样品/2.5小时
以99.7%的置信度明确区分浓度差别两倍（5000和10000拷贝）的样品的定量结果
十二万种Taqman Gene Expression Assays人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒
二百万种Taqman Validated SNP Genotyping Assays人、大鼠、小鼠基因组SNP检测试剂盒
Custom Assays代客设计、合成引物探针服务
四、荧光实时定量PCR要购买哪些试剂和材料
假如你想做荧光定量PCR的根据实验思路来说应该需要一下试剂和仪器
1.模板提取（一般为RNA）：Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理水
2.模板浓度测定：分光光度计或NanoDrop
3.逆转录：逆转录试剂盒（或者一步法试剂盒），这一步可以用普通PCR做，也可以用水域做。
4.荧光定量PCR试剂：通常有用SYBR Green Mix做的，但是这里建议你用EvaGreen做，灵敏度和平行性都要好于SYBR Green，并且假设你那是ABI或者Stratagene的PCR假如用SYBR Green还需要加一步Rox很麻烦。
5.其他：除了以上的那些还需要离心管、PCR管或板（Axygen反应比较好）、移液枪等，暂时就想到这么多。
五、荧光定量pcr仪有哪些品牌
进口的有：ABI的，BIO-RAD的iQ5\x0d\x0aApplied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准\x0d\x0aBIONEER：国内的用户可能听说过这个品牌的不多，只有早期较多使用进口引物的实验室和研究所或留美学者知道这个品牌。Bioneer最初是以高通量的引物合成起家，引物合成在国际上有很高的知名度。后经10几年发展产品线已覆盖整个分子生物学领域，目前同takara的产品线几乎完全一样。BIONEER的普通梯度PCR仪的价格同其他进口设备的价位比较，很具有杀伤力。这家公司也于2006年底推出了荧光定量PCR仪ExicyclerTM 96，产品技术参数也是采用96孔Peltier半导体加热，5通道，16bit CCD检测，也带有梯度功能。这款产品的参数几乎与Bio-rad的IQ5一模一样，而且检测的CCD像素还要高于IQ5,理论上检测灵敏度应该更好一些。产品价格据说还要比Bio-rad更低一些，号称是性价比最高的荧光定量PCR仪。但是缺点是现在国内用户很少，了解起来不太容易。有兴趣的客户可以联系北京力途科技有限公司进行试用，新公司都注重是售后服务，大家毕竟要亲身体会到才是最可靠的。\x0d\x0aStratagene：Stratagene现在为安捷伦公司的子公司，也是专著于分子生物学研究产品开发的公司。在国内它的试剂产品卖的不多，处于推广阶段。Stratagene的荧光定量PCR产品Mx3005P同以上两种产品技术参数也差不多96孔Peltier半导体加热，5通道，PMT检测器，但是没有梯度功能，用户不能在这台仪器上优化反应条件。另外有客户反应该仪器做工较粗糙，噪音比较大，而且边缘的孔做实验的效果不太好，但是只要使用热模块中间的孔做实验效果还是不错的。这样的问题问题在ABI7500仪器上也同样存在，但是Stratagene的价格要实惠很多。\x0d\x0a\x0d\x0a国产的：\x0d\x0a西安天隆科技有限公司的TL988型实时荧光定量PCR仪\x0d\x0a杭州博日的FQD-48A
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